魚に適した固定液とは
　それでは，魚を固定するにはどのような固定液が適しているのでしょうか？純粋に形態観察 のみを目標として考えると，まず候補にあげられるのがBouin液です。ホルマリン単独固定と 異なり，ピクリン酸や酢酸などによりタンパク質を直ちに変性・凝固させて死後変化を停止さ せ，それをさらに，後からホルマリンがゆっくり固定するという原理で固定が進行すると想像 され，これは他の多くのホルマリンを含む固定液にも共通する思われます。また，酢酸が含ま れているため脱灰も同時にできるというのも，魚の固定液としては便利です。Bouin液なら神 経組織もわりときれいに固定することができます。比較的組織も硬くなりすぎないので一般的 に魚類の組織形態を観察したり，大きな切片を作って広い範囲を検査したい病理組織学的分野 に向いていると思います。しかし，Bouin液の欠点として，染色性があまりよくないというこ とがあります。特にアザン染色のように微妙な染め分けを要する染色は，もちろん可能ですが ，あまりきれいな結果が出ないような気がします。これは以下に述べるDavidson液も同じかも しれません。
無脊椎動物には
　水産では魚に限らず，エビなどの甲殻類や，貝などの軟体動物も扱います。数年前に，ご存 じの「アコヤガイの大量死」問題が発生し，当時養殖研の病理部に所属していた私もアコヤガ イを固定して組織切片を作ることになりました。そこで軟体部をBouin液で固定したのですが ，驚いたことに魚には万能と思われたBouin液なのにあまり固定がよくありません。とくに消 化盲嚢がひどく，病変があったとしてもよくわからないような状態でした。そこで昇汞ホルマ リン液を用いたところ，非常にきれいなプレパラートを作ることができました。後にDavidson の固定液でも十分良好な標本が作れることがわかり，使いやすさの点からその後はそちらを使 っています。ちなみにアコヤガイを扱っている人は，アコヤガイは丈夫な生き物で水から出し て宅急便で送っても十分生きているとお考えになっているようです。確かに生きてはいますが さすがにだいぶストレスがかかるようで，宅急便で送られてきた直後の貝は性能のよい（強い ）固定液で固定しても，例の消化盲嚢の形態が悪くなります。どこがどう悪いと具体的にいう のは難しいのですが，全体に固定がとても悪いというような感じになってしまいます。送られ てきてから一週間くらい海水中で回復させると再びきれいな組織標本ができるようになります 。（実は魚でも不健康な個体からは，たとえ固定する組織自体に病変が無くともなぜか満足の いくプレパラートができません。）
　Davidson液はもともと二枚貝のために考案された固定液らしく，無脊椎動物の研究者の間で は以前から一般的に使われていたようです。酢酸を含むため甲殻類の固定にも十分威力を発揮 します。現在，世界中でエビ養殖が盛んになるにつれ，さまざまなエビの病気が発生していま すが，エビの病理組織学的観察のために使われているのは多くの場合Davidsonの固定液だと思 います。実は私もクルマエビのPAV（エビの急性ウイルス性敗血症）による大量死が問題にな ったときにエビの専門家である山口水試の桃山氏からこの固定液がよいと教えていただきまし た。また，殻長１cm程度のアワビの稚貝なども殻ごと固定でき，数日で殻がぺらぺらに脱灰さ れてはずせるようになります。たとえ無脊椎動物でも理屈では死後変化が十分遅ければホルマ リン単独でもきっちり固定できるでしょうが，よくわからないときはDavidson液を使うのが無 難であるといえるでしょう。
　Davidson液がもうひとつBouin液より優れているのは，液を調製 後室温で長期保存が可能な点で，少なくとも2～3ヶ月程度は大丈夫のようです。Davidson液で は基本的にBouin固定と同じ様な感じの組織像が得られます。ただ，Bouin液による固定より組 織が微妙に硬くもろくなり，切片を作りにくく感じることがあるようです。
なお，これはBouin液にも共通することですが，これらの固定液で固定すると，細胞核中の染色質が周辺ある いは中央部（仁）に濃縮するように見え，したがって核のコントラストが強くなるため，一見 標本がきれいにできているように感じられます。もちろんこれはアーティファクトですが，こ のため光顕レベルで核の無構造化などを特徴とするウイルス病（PAVなど）などを調べるとき には病変の起きた核と正常な核の違いが明瞭になるため，特に使いやすいといえます。

ほんとによく固定できる固定液は何？
　アコヤガイでの経験から，おそらく昇汞ホルマリンやDavidsonの固定液などの方がBouin液 などより固定力が強いと思われます。それでは魚でもBouin液よりDavidson液の方がよく固定 されるのでしょうか？試した限りではどうもその通りで，Davidson液のほうがBouin液よりわ ずかながら形態保持が優れているようです。したがって，現在私は魚でも一般的な形態観察の ためには原則的にDavidson液を使っています。
　これまであげた固定液を（私の感じた）固定の強い順に並べると，昇汞ホルマリン＞ Davidson＞Bouin＞１０%ホルマリン，となります。では，この固定の強さとはいったい何なの でしょうか？　おそらく固定が強いと感じられるものほど生体組織中のタンパク質等が分解， 溶出せずに標本中に保持されている程度が大きいものと思われます。おそらくそのせいもある のだと思いますが（他にも化学的な理由があるのでしょうが），強い固定液で固定したものほ ど，パラフィンブロックをミクロトームで薄切するときに組織が堅く，もろく感じられます。 このような固定液で固定した組織は５mm以上の厚さでは切片にチャター（ナイフの刃と平行に ひびが入る）ができやすく，３～４mm程度の切片の方がきれいに作りやすいという傾向があり ます（特に昇汞ホルマリン液）。したがって大きな切片をつくって低倍率で広い範囲を観察し たいときなどには不向きといえます。
　昇汞ホルマリン液というのは強力な固定液ですが，いくつかの大きなデメリットがあります 。まず，昇汞（塩化第二水銀）を含むため，固定後は重金属廃液として処理しなければならな いことです。次に固定した組織には水銀を含む微細な黒い粒子が沈着するため，切片をルゴー ル液等で処理しなければなりません（詳細は組織学の本を見ていただくか，問い合わせていた だければお答えします）。
また，昇汞のタンパク質凝固力は非常に強く，大きな組織片では表 面近くに凝固したタンパクの層ができてしまい，それ以上の液の浸透が悪くなるため，通常固 定する組織片は５mm以下の厚さにする必要があるということなどです。しかし，昇汞ホルマリ ンによる組織形態の保存はすばらしく，Bouin液などと異なり核のコントラストがそれほどで もないので，一見，見栄えがしないように思えますが，よくみると電顕用に樹脂包埋した組織 の準超薄切片のような感じのプレパラートが作れます。また組織の染色性も良好です（濃く染 まるという意味ではない）。したがって，ある程度細胞の内部を観察したいときや内分泌細胞 の染め分けをしたいときなどには最適で，下垂体などはHE染色のみでもある程度好酸性，好塩 基性細胞の染め分けができます。抗原性の保存も，ものにもよりますがBouin液より優れるこ とが多く，私の経験では下垂体の内分泌細胞の酵素抗体法で，Bouin液にくらべ一次抗体の濃 度を数倍薄めることができました。また，同様の目的で使われるBouin-Hollande Sublimateに くらべても形態の保存が勝っていると思います。
　さて，以上のように固定液でもさまざまな異なった性質や特徴があることがおわかりいただ けたかと思います。ここにあげたのはいずれもホルマリンを含んだ固定液で，これ以外にも数 多くの固定液がありますが私自身あまりいろいろな固定液を試したことがないので，比較的よ く使ってきたものについてのみ紹介しました。拙文がきれいな組織標本を作るための一助とな れば幸いです。 以下に各固定液の処方を示します。

Bouin液：ピクリン酸飽和水溶液７５ml＋市販のホルマリン原液２５ml＋氷酢酸５ml（使用直 前に混合）
Davidson液：９５%エタノール３３ml＋市販のホルマリン原液２２ml＋氷酢酸１１.５ml＋蒸留 水３３.５ml
昇汞ホルマリン液：飽和昇汞（塩化第二水銀）水溶液７０ml＋市販のホルマリン原液３０ml （使用直前に混合）

（生物機能部生物特性研究室長）